一、微生物生長(zhǎng)控速的目的

微生物發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行控速的目的是多方面的，主要可以歸結(jié)為以下幾點(diǎn)：

1.優(yōu)化生長(zhǎng)條件：微生物的生長(zhǎng)和代謝受到多種環(huán)境因素的影響，包括溫度、pH值、溶解氧、基質(zhì)濃度等。通過(guò)控速，可以調(diào)整和優(yōu)化這些環(huán)境因素，為微生物提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)條件，從而促進(jìn)其快速生長(zhǎng)和高效代謝。

2.提高產(chǎn)物產(chǎn)量：在發(fā)酵過(guò)程中，微生物會(huì)合成目標(biāo)產(chǎn)物（如抗生素、酶、有機(jī)酸等）?？厮倏梢源_保微生物在一定狀態(tài)下進(jìn)行代謝活動(dòng)，從而提高產(chǎn)物的合成速率和產(chǎn)量。如果發(fā)酵速度過(guò)快，可能會(huì)導(dǎo)致底物迅速耗盡，產(chǎn)生抑制微生物生長(zhǎng)的副產(chǎn)物，或者使微生物提前進(jìn)入衰亡期，降低產(chǎn)物產(chǎn)量。

3.保持發(fā)酵穩(wěn)定性：發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定性對(duì)于確保產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)量至關(guān)重要。通過(guò)控速，可以維持發(fā)酵過(guò)程中的各種參數(shù)在穩(wěn)定范圍內(nèi)，避免劇烈波動(dòng)對(duì)微生物生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生不利影響。這有助于減少發(fā)酵失敗的風(fēng)險(xiǎn)，提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。

4.節(jié)約能源和資源：在發(fā)酵過(guò)程中，需要消耗大量的能源和資源（如電力、蒸汽、底物等）。通過(guò)合理的控速，可以優(yōu)化能源和資源的利用效率，減少浪費(fèi)和成本。例如，在溶解氧控制方面，通過(guò)精確調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度，可以確保發(fā)酵液中的溶解氧濃度維持在適宜范圍內(nèi)，避免過(guò)度通氣造成的能源浪費(fèi)和底物氧化損失。

5.應(yīng)對(duì)不同發(fā)酵階段的需求：發(fā)酵過(guò)程通常包括適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期等不同階段。每個(gè)階段對(duì)環(huán)境條件和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。通過(guò)控速，可以根據(jù)不同發(fā)酵階段的需求調(diào)整發(fā)酵條件，確保微生物在每個(gè)階段都能獲得穩(wěn)定的生長(zhǎng)和代謝環(huán)境。

Tips：耀海生物通過(guò)優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基和發(fā)酵控制策略，建立了適用于質(zhì)粒生產(chǎn)的大腸桿菌高密度發(fā)酵平臺(tái)工藝，培養(yǎng)周期30h內(nèi)，質(zhì)粒產(chǎn)量超過(guò)1g/L。

此外，耀海生物能夠針對(duì)不同的質(zhì)粒和宿主菌，基于單因素或DoE方法提供工藝優(yōu)化解決方案，定制化滿足質(zhì)粒高產(chǎn)量、高質(zhì)量需求。

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二、發(fā)酵過(guò)程控速的直接原因

2.1剪切力

由于某些微生物比較脆皮，高轉(zhuǎn)速可能會(huì)導(dǎo)致微生物的破裂：

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細(xì)胞破裂：

?高剪切力可能直接導(dǎo)致微生物細(xì)胞壁的破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)。這不僅會(huì)影響微生物的存活率，還可能對(duì)后續(xù)的發(fā)酵或處理過(guò)程產(chǎn)生不利影響。

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代謝產(chǎn)物泄漏：

?細(xì)胞破裂后，細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物會(huì)泄漏到環(huán)境中。這些代謝產(chǎn)物可能具有生物活性或毒性，對(duì)環(huán)境和人類健康造成潛在威脅。

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發(fā)酵效率降低：

?如果大量微生物細(xì)胞在發(fā)酵過(guò)程中破裂，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中細(xì)胞濃度的降低，從而影響發(fā)酵效率和產(chǎn)物產(chǎn)量。

2.2氧中毒

對(duì)于好氧微生物來(lái)說(shuō)，氧中毒的機(jī)理主要涉及氧自由基的過(guò)量生成與損害以及抗氧化防御系統(tǒng)的失衡。在高氧濃度或壓力下，好氧微生物可能面臨氧化應(yīng)激的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞以及細(xì)胞死亡。因此，在培養(yǎng)和應(yīng)用好氧微生物時(shí)，需要控制適當(dāng)?shù)难鯕鉂舛群蛪毫l件，以確保其正常生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)。因此需要通過(guò)限制通氣比進(jìn)行控速發(fā)酵。

a.在高通氣狀態(tài)下：如果微生物所處的環(huán)境中氧氣濃度過(guò)高，可能會(huì)對(duì)其造成損害，甚至導(dǎo)致死亡。這種損害機(jī)制可能與氧自由基的生成和攻擊有關(guān)。

b.控制通氣量：在發(fā)酵過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)微生物的需求和耐受性合理控制通氣量，避免過(guò)高或過(guò)低的氧氣濃度。

c.監(jiān)測(cè)氧濃度：定期監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中的氧濃度，確保其在適宜的范圍內(nèi)。

d.優(yōu)化發(fā)酵條件：除了通氣量外，還應(yīng)關(guān)注其他發(fā)酵條件如溫度、pH值、底物濃度等，以創(chuàng)造適合微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的環(huán)境。

e.加強(qiáng)設(shè)備維護(hù)：確保發(fā)酵設(shè)備處于良好狀態(tài)，避免設(shè)備故障導(dǎo)致通氣量異常。

2.3底物抑制

高濃度底物會(huì)抑制微生物代謝，主要是因?yàn)橐韵聨讉€(gè)方面：

1. 底物濃度的增加會(huì)導(dǎo)致溶液的滲透壓升高，從而影響微生物的生長(zhǎng)和繁殖。高濃度的底物會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)和繁殖，因?yàn)檫^(guò)高的滲透壓會(huì)破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞失水或過(guò)度吸水，從而對(duì)細(xì)胞的正常功能產(chǎn)生影響。

2. 高濃度的底物可能會(huì)導(dǎo)致代謝途徑的飽和。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定水平時(shí)，相應(yīng)的酶可能會(huì)達(dá)到飽和狀態(tài)，從而導(dǎo)致底物濃度進(jìn)一步增加時(shí)，反應(yīng)速度不再增加。

3. 高濃度的底物還可能會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生代謝 overflow現(xiàn)象。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí)，微生物可能會(huì)啟動(dòng)不必要的代謝路徑，導(dǎo)致能量浪費(fèi)和副產(chǎn)物的生成，這也會(huì)影響目標(biāo)產(chǎn)物的的學(xué)習(xí)。

在微生物代謝研究中，控制底物濃度對(duì)于調(diào)節(jié)代謝途徑、提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量和效率具有重要意義。

2.4產(chǎn)物抑制

產(chǎn)物濃度過(guò)高會(huì)顯著抑制微生物的生長(zhǎng)與代謝，減緩發(fā)酵速率，甚至導(dǎo)致發(fā)酵失敗。高濃度產(chǎn)物可能直接毒害細(xì)胞，影響酶活性和代謝途徑，同時(shí)增加發(fā)酵液滲透壓，破壞細(xì)胞平衡。因此，控制發(fā)酵速率至關(guān)重要，通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件、添加抑制劑等手段，維持適宜的產(chǎn)物生成速度，防止過(guò)度積累。同時(shí)，提升產(chǎn)物分離速率，實(shí)現(xiàn)邊發(fā)酵邊分離的耦合工藝，能有效降低產(chǎn)物濃度，減輕抑制作用，保障發(fā)酵過(guò)程穩(wěn)定進(jìn)行，提高產(chǎn)物產(chǎn)量與品質(zhì)。解決方案以耦合發(fā)酵或灌流培養(yǎng)為主。

耦合發(fā)酵工藝，即邊發(fā)酵邊分離的技術(shù)，是一種將發(fā)酵過(guò)程與產(chǎn)物分離過(guò)程緊密結(jié)合的先進(jìn)工藝。它通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中采用適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)，如膜分離、萃取等，實(shí)時(shí)將產(chǎn)物從發(fā)酵液中分離出來(lái)，從而有效降低產(chǎn)物濃度，解除對(duì)微生物的抑制作用，提高發(fā)酵效率和產(chǎn)物產(chǎn)量。這種工藝不僅優(yōu)化了發(fā)酵過(guò)程，還提高了產(chǎn)品的純度和回收率，是現(xiàn)代生物發(fā)酵工業(yè)的重要發(fā)展方向。

2.5畸形合成

a.mRNA穩(wěn)定性下降：在快速生長(zhǎng)的條件下，細(xì)胞內(nèi)的mRNA穩(wěn)定性可能會(huì)受到影響，導(dǎo)致與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的mRNA降解速度加快。這將減少可用于翻譯的mRNA數(shù)量，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成。

b.核糖體功能受損：雖然核糖體本身不會(huì)因生長(zhǎng)速率過(guò)快而直接減少，但快速生長(zhǎng)可能導(dǎo)致的代謝壓力增加和資源分配不均等問(wèn)題可能間接影響核糖體的功能。例如，核糖體可能無(wú)法獲得足夠的能量或氨基酸來(lái)支持高效的蛋白質(zhì)合成。

c.蛋白質(zhì)折疊和修飾異常：由于缺乏高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在快速生長(zhǎng)的細(xì)胞可能無(wú)法為新生蛋白質(zhì)提供足夠的折疊和修飾環(huán)境。這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)無(wú)法正確折疊成具有生物活性的構(gòu)象，或者無(wú)法獲得必要的糖基化、磷酸化等修飾，從而影響其功能和穩(wěn)定性。

由于以上所述原因，對(duì)于原核類微生物來(lái)說(shuō)通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基成分、補(bǔ)料策略、溫度等方式來(lái)控制微生物的生長(zhǎng)速率，有助于保持細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡和基因表達(dá)調(diào)控的穩(wěn)定，從而提高蛋白質(zhì)的合成效率和質(zhì)量。

2.6能量分配與物質(zhì)分配

在微生物工藝中，控速發(fā)酵是確保各階段平衡的關(guān)鍵。通過(guò)精細(xì)調(diào)控發(fā)酵速率，可以優(yōu)化時(shí)間、生物量、營(yíng)養(yǎng)和能源的分配。通過(guò)分段工藝設(shè)計(jì)，綜合考慮微生物生長(zhǎng)周期，維持適宜的生長(zhǎng)條件，避免過(guò)快或過(guò)慢導(dǎo)致資源浪費(fèi)或產(chǎn)物抑制?？厮侔l(fā)酵旨在實(shí)現(xiàn)資源較大化利用，提高產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量，是現(xiàn)代生物發(fā)酵工業(yè)的重要策略。

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三、控速策略

微生物發(fā)酵控速的邏輯很大程度上是圍繞控制微生物體內(nèi)酶催化反應(yīng)的速率來(lái)展開的。酶是生物體內(nèi)催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)，它們能夠加速反應(yīng)進(jìn)程而不改變反應(yīng)的總能量變化。在微生物發(fā)酵過(guò)程中，酶催化反應(yīng)的速率直接影響著代謝產(chǎn)物的生成速度和發(fā)酵效率?？焖偾曳€(wěn)定的酶催化反應(yīng)速率有助于提高發(fā)酵效率，減少發(fā)酵時(shí)間，并可能提高產(chǎn)物的純度和產(chǎn)量。

3.1溫度控制

酶的活性受溫度影響顯著。一般來(lái)說(shuō)，每種酶都有其適溫度范圍，在此范圍內(nèi)酶活性高，反應(yīng)速率快。因此，通過(guò)控制發(fā)酵溫度，可以調(diào)控酶催化反應(yīng)的速率。

例如，對(duì)于某些需要高溫發(fā)酵的微生物，可以提供適宜的高溫環(huán)境來(lái)加速酶催化反應(yīng)；而對(duì)于需要低溫發(fā)酵的微生物，則需要保持較低的溫度以維持酶的活性。

3.2pH值調(diào)控

酶的活性也受pH值的影響。每種酶都有其較適pH值范圍，偏離此范圍酶活性會(huì)下降甚至失活。因此，通過(guò)調(diào)控發(fā)酵液的pH值，可以影響酶催化反應(yīng)的速率?？梢远ㄆ跈z測(cè)發(fā)酵液的pH值，并根據(jù)需要添加酸堿調(diào)節(jié)劑來(lái)保持較適發(fā)酵狀態(tài)。

3.3底物濃度與營(yíng)養(yǎng)條件

底物濃度是影響酶催化反應(yīng)速率的重要因素之一。底物濃度過(guò)高可能導(dǎo)致底物抑制效應(yīng)，降低反應(yīng)速率；而底物濃度過(guò)低則可能限制反應(yīng)速度。因此，需要控制底物的投加量和投加速度，以維持適宜的底物濃度范圍。

此外，微生物在發(fā)酵過(guò)程中還需要一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)維持其生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)。提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有助于提高酶催化反應(yīng)的速率和效率。

3.3溶氧量與通氣量

對(duì)于好氧微生物來(lái)說(shuō)，溶氧量是影響其代謝活動(dòng)的重要因素之一。通過(guò)控制通氣量和攪拌速度等參數(shù)，可以調(diào)控發(fā)酵液中的溶氧量水平，從而影響酶催化反應(yīng)的速率。一般來(lái)說(shuō)，在好氧發(fā)酵過(guò)程中需要保持較高的溶氧量水平以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)；而在厭氧發(fā)酵過(guò)程中則需要保持較低的溶氧量水平以避免氧氣對(duì)厭氧微生物的抑制作用。

3.4發(fā)酵時(shí)間的累積控制

發(fā)酵時(shí)間也是影響酶催化反應(yīng)速率和產(chǎn)物生成量的重要因素之一。通過(guò)控制發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短可以調(diào)控微生物的代謝活動(dòng)和產(chǎn)物的生成量。在實(shí)際操作中需要根據(jù)具體的發(fā)酵工藝和產(chǎn)物需求來(lái)確定合適的發(fā)酵時(shí)間范圍。

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四、哪些類型的發(fā)酵需要控速

4.1高耗氧菌株

高耗氧菌株指那些在生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中需要大量氧氣的微生物種類。這些菌株在消耗氧氣方面效率較高，常見于各種基因工程菌，在生物降解、污水處理等需高氧環(huán)境的工業(yè)應(yīng)用中。例如，枯草芽孢桿菌作為一種典型的高耗氧菌株，在廢水處理中能夠迅速消耗大量氧氣，有效分解有機(jī)污染物，顯著降低水體化學(xué)需氧量。其高效的耗氧能力使其成為環(huán)保領(lǐng)域的重要微生物資源。

4.2剪切力敏感菌株

對(duì)剪切力敏感的微生物主要包括但不限于以下幾類：

a.植物細(xì)胞，植物細(xì)胞由于其細(xì)胞壁僵硬脆弱且胞內(nèi)存在較大的液泡，對(duì)剪切力相對(duì)敏感。適當(dāng)?shù)募羟辛梢源龠M(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增強(qiáng)代謝，但過(guò)大的剪切力會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械性損傷，降低細(xì)胞活性或破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)代謝。具體例子：如紅花細(xì)胞（Carthamus tinctorius L.），其耐受剪切力的閾值較低，當(dāng)剪切力超過(guò)一定范圍時(shí)，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝。

b.乳動(dòng)物細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，其細(xì)胞膜相對(duì)較為脆弱，容易受到外界機(jī)械力的影響。此外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常具有較大的尺寸，這使得它們更容易受到剪切力的影響。

c.檸檬酸發(fā)酵中的黑曲霉：檸檬酸黑曲霉作為檸檬酸發(fā)酵的主要生產(chǎn)菌，是一種剪切力敏感型微生物。其形態(tài)學(xué)特征會(huì)顯著影響檸檬酸的產(chǎn)量。在檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中，過(guò)大的剪切力可能會(huì)影響黑曲霉的生長(zhǎng)和代謝，從而影響檸檬酸的產(chǎn)量。

d.不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞：植物細(xì)胞在不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)剪切的響應(yīng)也不同。例如，處于對(duì)數(shù)期的紅豆杉細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。

剪切力對(duì)微生物的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不僅與微生物的種類和生長(zhǎng)階段有關(guān)，還與剪切力的強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間以及環(huán)境條件等多種因素有關(guān)。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體情況對(duì)剪切力進(jìn)行控制和優(yōu)化，以確保微生物的生長(zhǎng)和代謝處于穩(wěn)定的狀態(tài)。

4.3原核類微生物

原核微生物則沒(méi)有成形的細(xì)胞核，也缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器，這限制了它們?cè)诘鞍踪|(zhì)翻譯后修飾和分泌方面的能力和速度。因此表達(dá)過(guò)程控速進(jìn)行。

4.4分段控制類發(fā)酵工藝

補(bǔ)料類工藝、溫敏類菌株、誘導(dǎo)類工藝、混菌類發(fā)酵、氧切換發(fā)酵、底物切換類發(fā)酵等都需要進(jìn)行分段工藝設(shè)計(jì)，分段工藝在某些時(shí)期進(jìn)行控速調(diào)節(jié)。

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五、控速階段選擇

5.1全程控速

如某些酒類的發(fā)酵過(guò)程追求低溫長(zhǎng)時(shí)發(fā)酵，由于發(fā)酵速度較慢，微生物有足夠的時(shí)間來(lái)分解和利用原料中的成分，從而產(chǎn)生更多的風(fēng)味和香氣物質(zhì)。這些物質(zhì)能夠賦予發(fā)酵制品獨(dú)特的風(fēng)味和香氣，使得產(chǎn)品更加具有吸引力和競(jìng)爭(zhēng)力。例如，在釀酒過(guò)程中，低溫緩慢發(fā)酵有利于醇甜物質(zhì)和酯類物質(zhì)的形成，使得酒質(zhì)更加醇厚、香氣更加濃郁。

5.2生長(zhǎng)期控速

生產(chǎn)大罐時(shí)期，對(duì)于生長(zhǎng)偶聯(lián)類微生物發(fā)酵有可能需要全程控速，將生長(zhǎng)曲線的生長(zhǎng)期做長(zhǎng)，使得微生物更多的時(shí)間處于生長(zhǎng)期，從而增加表達(dá)時(shí)間。

5.3種子期控速

生長(zhǎng)過(guò)快會(huì)導(dǎo)致老化，有的時(shí)候也需要通過(guò)調(diào)整理化參數(shù)適配接種時(shí)間點(diǎn)等。